Biologi so razvili sistem CRISPRoff, ki je sposoben ciljno zatirati gensko aktivnost brez vnosa mutacij v DNK. Mehanizem tega orodja temelji na epigenetskem reprogramiranju, ki je neodvisno od mest metilacije CpG v genih. Zatiranje aktivnosti gena CRISPRoff je dedno, kar se je pokazalo v generacijah izvornih celic, ki se razvijajo v nevrone. Znanstveniki so ustvarili tudi orodje, ki lahko po CRISPRoffu obnovi gensko aktivnost, in ga poimenovali CRISPRon. Raziskava je objavljena v reviji Cell.
Od urednika
Sprva se je zapis imenoval "CRISPR orodje je uredilo genom brez prelomov DNK", prej pa so obstajali sistemi, ki temeljijo na "mrtvem" Cas9 (mrtvi Cas9) in so sposobni spreminjati epigenom. Toda v takšnih delih v nasprotju s tistim, ki je obravnavano v zapisku, dedovanje sprememb v generacijah delitvenih celic ni bilo preverjeno, kar se odraža v popravljenem naslovu. Sistem za genomsko urejanje, usmerjen v CRISPR / Cas9, je eno najbolj zahtevanih orodij v bioloških raziskavah. Tak sistem omogoča prekinitve na določenem mestu v genomu z uporabo proteina Cas9 v kombinaciji z vodilno RNA, ki se najpogosteje uporablja za dva namena: "izklop" pokvarjenega gena ali vstavljanje novega zaporedja v prekiniti. Pridobitev modelov z nedelujočimi geni omogoča preučevanje njihovih funkcij in spreminjanje lastnosti organizmov glede na naloge znanstvenikov. Za odkritje mehanizmov delovanja sistema CRISPR / Cas leta 2020 so Nobelovo nagrado prejeli raziskovalki Emmanuelle Charpentier in Jennifer Doudne.
Kljub vsestranskosti te metode je njena uporaba omejena s potrebo po prelomih v zaporedju DNA, kar pogosto vodi do mutacij v neciljnih regijah genoma in nepravilnega popravljanja DNA v ciljnih. Na primer zloglasni He Jiangkui, ki je najprej prejel gensko spremenjene otroke (in nato zaporno kazen), v svojih poskusih ni mogel nadzorovati natančnosti CRISPR - v genomih dvojčkov so bile nenamerne mutacije.
Biologi na Kalifornijski univerzi so ustvarili mehanizem CRISPR, ki lahko izklopi gene, ne da bi v DNK vnesel prelome in mutacije. Temelji na epigenetskem reprogramiranju - metilaciji nukleotidov (pritrditev na njih metilne skupine) tako, da gen izgubi afiniteto za transkripcijske encime in preneha delovati. Biologi so svoj razvoj poimenovali CRISPRoff.
Tako kot v klasičnem orodju CRISPR je ena od njegovih sestavin beljakovina Cas9, vendar ne navadna, ampak "mrtva" (deadCas) - to pomeni, da se lahko veže le na želeno območje DNK, vendar ne naredi preloma. Pridružile so se mu še druge katalitične domene - metiltransferaze. Tako je himerni protein lahko metiliral DNA nukleotide okoli sebe in zaviral aktivnost genov. Hkrati pa že 10 dni po dodajanju proteina celicam ni bilo več zaznati, čeprav je njegov učinek vztrajal do 15 mesecev študije. Specifičnost in učinkovitost sistema sta potrdili sekvenciranje RNA - potlačeni geni praktično niso imeli prepisov. Učinek CRISPRoff so opazili tudi pri genih, pri katerih otoki CpG niso bili označeni - dvo -nukleotidna mesta v DNK, pri katerih v celici pride do naravne metilacije, to pomeni, da se lahko potencialno uporabi za katero koli zaporedje v genomu.
Biologi so tudi potrdili, da je mogoče metilacijo CRISPRoff obrniti. V ta namen so ustvarili podobno orodje - CRISPRon. Ta beljakovina je bila sestavljena tudi iz inaktiviranega Cas in encima, vendar je bil tokrat sredstvo za demetiliranje. Za preizkušanje njegovega dela so biologi uporabili celice, v katerih je bil gen CLTA že metiliran. V desetih dneh po uporabi CRISPRona je bila normalna raven gena v celicah obnovljena (p <0, 0001).
Da bi preverili, kako učinek CRISPRoff traja med diferenciacijo induciranih matičnih celic (ISC) v druge vrste celic, so jih biologi obdelali z beljakovino in jih nato ponovno programirali v nevrone. To je ena najpogostejših metod pridobivanja živčnih celic za raziskave, zadrževanje metilacije med diferenciacijo pa je pomembna lastnost uporabe instrumenta. Izkazalo se je, da so nevroni dejansko obdržali metilne oznake na genih, ki so jih izbrali znanstveniki.
Tudi drugi sistemi se razvijajo na podlagi tehnologije CRISPR / Cas. Na primer, nedavno se je učinkovitost metode povečala s fotoindukcijo, nastalo pa je tudi orodje, ki lahko ureja več genov hkrati in iz njih izreže območja.
